sgRNA的设计与载体构建
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sgRNA的设计与载体构建
sgRNA的设计与载体构建
方法标签：
生物化学与分子生物学,
贡献用户：
戚某某
方法分类：
分子生物学 > DNA酶切、连接及转化
方法来源：
上海交通大***附属仁济医院
创建时间：
2018/02/06 16:27:32
实验概要
1. CRISPR的介绍： ? ? ? CRISPR的全称为Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(规律成簇的间隔短回文重复序列)。实际上就是一种基因编辑器，由于细菌自身具有降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制，从而科学家发现了CRISPR系统。也就是说，一些具有逆转录功能的病毒（如：慢病毒）能把自己的基因整合到细菌上，细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，从而进化出CRISPR系统。
2. CRISPR的元件： ? ? ? CRISPR系统包含两个组件，一个是sgRNA，另一个就是Cas 9蛋白。sgRNA是一个短的合成RNA，只有20bp大小，可以与Cas9蛋白结合，所以在设计sgRNA之前，应在基因组上寻找PAM序列（PAM：Protospacer Adjacent Motif），PAM序列是有固定形式的，来自于不同菌种属的Cas，它的PAM序列形式是不一样的。我们现在用的是SpCas 9，Cas 9蛋白来源于S. pyogenes （化脓链球菌）II型CRISPR系统。所以，我们的PAM序列应该为-NGG的形式，“N”可以是A,T,C,G中的任何一个。Cas 9其实就相当于是限制性核酸内切酶，使PAM序列前形成DSB（Double Strand Break）。所以，sgRNA其实相当于是向导，告诉Cas 9蛋白在哪进行切割。
? ? ? 所以，我们要做的就是将设计好的sgRNA进行合成，并将其连接到含有Cas 9的载体上。并转化到Stellar、Stable或Stable3感受态中，进行表达。 ?
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实验原理 ? ? ? 规律间隔成簇短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, CRISPR）本身是一种防御系统，用以保护细菌和古细菌细胞不受病毒的侵害。在这些生物基因组中的CRISPR位点能表达与入侵病毒基因组序列相匹配的小分子RNA 。当微生物感染了这些病毒中的一种，CRISPR RNA就能通过互补序列结合病毒基因组，并表达CRISPR相关酶，也就是Cas，这些酶都是核酸酶，能切割病毒DNA ，阻止病毒完成其功能。该切割DNA的机制与2012年被证实广泛适用于真核生物，从而引发了后续的以CRISPR/Cas9为基础的第三代基因编辑工具的研究热潮。在真核细胞中双链的DNA断裂（Double strand break, DSB）可以引发两种修复机制，其中非同源末端结合（Non-homologous end joining, NHEJ）可以产生数个碱基的随机删除或插入，从而引发移码突变，这便是基因编辑工具进行基因敲除的原理；此外在有同源序列存在时可以进行同源重组修复，该机制可以实现外源基因的敲入或者定点修饰。 ? ? ?相比前两代基因编辑工具ZFN系统和TALEN系统，CRISPR/Cas 9技术的优点比较显著。首先，CRISPR-Cas9系统的可用位置更多。理论上基因组中每8个碱基就能找到一个可以用CRISPR-Cas9进行编辑的位置，可以说这一技术能对任一基因进行操作，而TALEN和ZFN系统则在数百甚至上千个碱基中才能找到一个可用位点，这大大限制了使用范围。其次，Cas9扩展性强，正***使用的Cas9n，是一种只进行单链切割的Cas9突变型，该酶可以大大降低切开双链后带来的非同源末端连接造成的染色体变异风险。此外还可以将Cas9蛋白连接其他功能蛋白，来在特定DNA序列上研究这些蛋白对细胞的影响。第三，更为重要的是，CRISPR-Cas9系统的使用极为方便，只需要替换一段核酸序列，几乎任何实验室都可以开展工作。? 主要试剂 一、所需试剂： 1. PCR聚合酶：? 实验步骤
1. sgRNA的设计： （1）sgRNA的设计原则： ? ? ? ?1）sgRNA的长度：S. pyogenes II型CRISPR系统（SpCas 9）一般为20nt。
2）sgRNA序列的碱基组成：基因特异的sgRNA 模板序列为位于PAM 序列前，PAM序列的特征为NGG (N可以为任意核苷酸)，所以选择3'末端含有GG的sgRNA，这样可以构成PAM序列。同时，sgRNA的序列应避免以4个以上的T结尾，GC%含量最佳为30%-70%（40%-60%）。
3）sgRNA的序列与On-target和Off-target的匹配数都应尽可能的高，一般大于60，认为是可用的。
4）如果构建U6启动子或T7启动子驱动sgRNA的表达载体，需要考虑sgRNA的5'碱基为G或GG，来提高其转录效率。
5）全基因的脱靶效应分析，需要考虑脱靶位点的错配碱基数，最多不超过5个。 ? ? ? ? 6）如果想要造成基因移码突变，需要尽量靠近基因编码区的ATG下游，最好位于第一或第二外显子上。 （2）sgRNA的设计步骤
通过网址：https://doc.001pp.com/landing/cloud进行sgRNA的设计，进入网址后点击KNOCK OUT进入设计页面，输入想要设计sgRNA的名称后，进行sgRNA的选择。由于内含子在基因表达的过程中，不会进行表达且会被删掉，所以我们在设计sgRNA时一般在靠近启动子的第一个CDS区（也就是外显子的保守结构域）进行sgRNA的选择。在网站上，On-Target和Off-target都是有评分的，一般来说，评分越高，则sgRNA越好。On-Target其实就是sgRNA对目标位点识别后与DNA模板进行识别切割的的效率，所以准确性越高，On-Target的评分越高。Off-Target也就是脱靶效应，由于CRISPR技术的切割是由sgRNA根据PAM序列定位识别位点，从而进行切割，但是如果sgRNA识别的位点是错误的，就产生了错误切割，这样就产生了脱靶效应。所以说，在进行sgRNA选择的时候，要尽可能地选择脱靶效率比较低的，也就是Off-target分值比较高的。另外，符合sgRNA的其它设计原则就可以了。
2.?PCR扩增
1.?反应体系：
Mix
12.5 μL
R?
0.75 μL （10pmol/ μL） 5-7.5 pmol
F?
0.75 μL （10pmol/ μL） 5-7.5 pmol
模板
1000 bp，Buffer?NE或ddH2O需要加热到70℃后，再进行洗脱。）
连接反应
1. T4?DNA ligase连接反应体系：
T4?DNA ligase
1 ?μL
Insert Gene
?μL （
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