染色质免疫共沉淀(ChIP)实验
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染色质免疫共沉淀(ChIP)
一、实验原理
染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)是目前研究体内 DNA 与蛋白质相互作用最为主要的方法之一。本实验的原理是在活细胞状态下通过化学交联剂将蛋白质－DNA 复合物固定，并将其随机打断成一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学的方法沉淀出目的蛋白质－DNA 复合体，从而特异性地富集与目的蛋白相结合的DNA片段。通过对目的 DNA 片断的纯化与检测，最终获得蛋白质与 DNA 相互作用的信息。染色质免疫共沉淀技术广泛的应用于表观遗传（组蛋白等）分析，转录因子结合位点分析等蛋白质与DNA结合的实验分析中。随着第二代测序技术的逐步完善和成熟，染色质免疫共沉淀结合第二代高通量测序技术（ ChIP-seq）正逐步成为基因调控网络研究中一种非常有效的研究手段。
二、仪器或试剂
进口 1.5ml 离心管和进口 50ml 离心管 冷冻离心机
超声波仪（核对型号） 真空泵
振荡器 静音混合器
磁力架 （ Dynal, Invitrogen bead separation） 滤膜 Miracloth (Calbiochem: Cat.# 475855)
漏斗
实验所需试剂:
甲醛： Sigma， Cat.# F8775 2 M 甘氨酸
NaHCO3（ Sigma） 0.1 M PMSF (-20℃)： Amresco， Cat.# M145-5G
100× Protease inhibitors (PIs, -20 ℃)：Roche，Cat.# ***001
14.3 M β-ME (2-mercaptoethano, RT) 20 mg/ml Proteinase K (-20℃)： Fermentas， Cat.# EO0491(Takara, D9033)
10 mg/ml RNase A (DNase-free, -20℃)： Fermentas， Cat.# EN0531
Chloroform : Isoamyl Alcohol (24:1) (RT)
20 mg/ml Glycogen (-20℃)： Roche， Cat.# ***001
Protein A/G Dynabeads (4℃)： Invitrogen
Chloroform (RT) 3 M Sodium acetate (NaOAc, pH 5.2) (4℃)
70% and 100% Ethanol (RT) Antibody to be used for ChIP (-20℃) 0.5 M EDTA (pH 8.0, 4℃) 5 M LiCl (4℃)
1 M MgCl2 (4℃) 5 M NaCl (RT)
20% NP40 (Sigma， RT) 10% SDS (RT)
2 M Sucrose (4℃) 1 M Tris-HCl (pH 6.5 and pH 8.0，4℃)
20% Triton X-100 (Sigma, T8787, 4℃)
10% Sodium deoxycholate (上海生工分装，0613，RT)
操作步骤
A）实验材料的交联处理（室温）：
取幼嫩的组织（如发芽后的幼苗，幼嫩的叶片等） 2 g左右，将材料剪成尽可能的小的碎片装入50ml 离心管中，加入40ml 灭菌ddH2O清洗一遍，完全吸干水分，加入 1%甲醛交联液 30ml，真空交联 15min。 注意： a: 如果材料从田间或温室获得，则先用 ddH2O 清洗干净，并用面巾纸吸干水分。
b:为防止样品在交联过程中漂浮起来，可以用尼龙布或纱布将样品包好，或者用其他策略确保样品在交联过程中完全浸润在交联液中。
c:交联的时间是实验成败的关键因素之一，交联时间太短，则交联不够充分，难以沉淀到目的片段，交联时间太长，则容易产生过高的背景噪音。因此针对不同的实验条件和组织材料，实验人员应对交联的时间进行摸索和调整。一般而言，当交联的材料变得透明为宜。
交联完毕后加入 2ml 2M 甘氨酸使甘氨酸终浓度到达 0.125 M，混匀之后将样品重新放入真空仪，抽真空 5min 终止交联反应。 注意：真空泵升压的时候，应保持缓慢匀速，避免箱内压力的剧烈变化。
反应结束后在离心管中加入 40ml ddH2O 将样品清洗三遍，之后取出样品，放在多层面巾纸之间，尽可能的吸干水分，之后将交联好的样品放入液氮中， 置于-70℃保存（也可以直接进行下一步）。 注意： 样品取出后要尽可能完全的除去水分，以免影响后续的染色质抽提的过程。
B）实验材料的染色质抽提（冰上进行）：
按照试剂列表配制母液，所有试剂均用无菌的ddH2O配制，用到的离心管和枪头均需要灭菌处理（或者无菌的RNase 和 DNase free 的离心管和枪头）。
按以下配方配制Extraction buffer 1，其中β-ME在通风橱操作，Protesse inhibitor 1粒溶于1ml无菌ddH2O，-20℃ PMSF现用现加。
Extraction buffer 1 100ml
0.4m sucrose 2.3 M 20 ml
10mM Tris-HCl (pH8.0) 1 M 1 ml
10mM MgCl2 1 M 1 ml
5Mm β-ME 14.3 M 35 ul
0.1mM PMSF 0.1 M 100 ul
Protesse inhibitor 50 ul
ddH2O 76.865 ml
于50ml 离心管中加入30ml EB1，冰上预冷，用液氮研磨样品，取2g左右的粉末于试管中混匀，试管放于冰上，摇床轻摇30min。
剪取microcloth，将3中的溶液过滤两次，第一次单层过滤，第二次双层过滤（可轻轻挤压），滤液盛于新的50ml离心管中，4℃离心，4,000×g，20min。
取出离心好的试管，小心去上清，加入1ml Extraction buffer 2，对准离心管壁的沉淀部分反复的轻柔吹洗，大约 10-20 次后将重悬液转移至 1.5ml进口离心管中。
注意： 在吹洗管壁沉淀的时候，注意保持 50ml 离心管仍然在冰上。
Extraction buffer 2 10ml
0.25m sucrose 2.3 M 1.08 ml
10mM Tris-HCl(pH8.0) 1 M 0.1 ml
10mM MgCl2 1 M 0.1 ml
1% Triton X-100 20 % 500 ul
5Mm β-ME 14. 3M 3.5 ul
0.1mM PMSF 0.1 M 10 ul
Protesse inhibitor 50 ul
ddH2O 8.1565 ml
4℃离心， 12,000×g， 10min
用枪吸干上清，加入 300μl Extraction buffer 3 在冰上重悬染色质沉淀。
注意： a：此步骤中，得到的染色质沉淀应为白色或浅绿色，如果为深绿色，说明杂质较多，可以加入 1ml Extraction buffer 2 重复第 6 步，直至得到纯净的 染色质。
b：由于 Extraction buffer 3 非常粘稠，因此在进行重悬的时候会比较困难， 但是应小心避免产生气泡，少量的 PMSF 同样可以起到去除气泡的作用。
取一新的 1.5ml 离心管，加入 300μl Extraction buffer 3，然后小心将第 7 步中的重悬液转移至其上。
Extraction buffer 3（EB3） 10ml
1.7M sucrose 2.3 M 7.4 ml
10mM Tris-HCl (pH8.0) 1 M 0.1 ml
2mM MgCl2 1 M 0.02 ml
0.15% Triton X-100 20 % 75 ul
5Mm β-ME 14. 3M 3.5 ul
0.1mM PMSF 0.1 M 10 ul
Protesse inhibitor 50 ul
ddH2O 2.3415 ml
4℃离心， 16,000×g， 1hr。
离心好后弃上清，加入 400μl Nuclear lysis buffer 至染色质沉淀中，重新在核裂解液中悬浮染色质，冰上裂解15-20min。
Nuclear lysis buffer 5ml
50mM Tris-HCl (pH8.0) 1 M 0.25 ml
10mM EDTA 0.5M 0.1ml
1% SDS 10% 0.5 ml
Protesse inhibitor 50 ul
ddH2O 4.1 ml
注意： 在重悬的过程中应注意避免气泡的产生。
C）染色质的超声波片段化（冰上进行）：
重悬之后，每个样品取 20μl 保存作为超声前的对照，然后用超声仪将剩余样品片段化成合适大小的 DNA 片段。
将试管放置于超声仪的冰浴水槽中，设定30s 开/30s关为一个循环，总共30min，每隔5min换一次冰，保证样品一直处于冰水浴中。
注意：根据不同的实验目的调整超声的时间，一般而言，进行 qPCR 检测，超声时间可以短，片段大小在 400-1000bp 之间；如果进行高通量测序，则可延长超声时间使片段大小在 200bp 左右。
取 20μl 超声波片段化之后的染色质裂解液和超声前的 20μl 对照分别补灭菌 ddH2O水至 500ul，加20ul 5M NaCl， 65℃水浴解交联过夜，剩下的染色质裂解液保存于-80℃备用。
取出解交联产物，加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），手摇混匀 5min， 12,000×rpm 离心 10min，小心吸上清480μl 左右至新离心管中，加入100μl 3M NaAc， 900μl 预冷的无水乙醇和 2μl 肝糖原，置于-70℃沉淀 1 小时以上或-20℃沉淀过夜。
4℃离心，12,000×rpm， 15min，小心弃上清，加入 1ml 70%乙醇洗沉淀一次， 4℃离心 12,000×rpm，5min，小心弃上清，稍离心，用枪头小心吸干剩余残液，之后将离心管置于超净台上风干大约 15min，加入 20μl ddH2O 溶解半小时，用1.5%-2%左右琼脂糖凝胶电泳检测，若片段大小符合预期则进行下一步实验，如果片段过大，则可继续进行超声波处理。
D）染色质前处理和免疫共沉淀（ 4℃）：
1. 孵育抗体和磁珠 (Tube A‘和 Tube B‘)
a) 取 1ml 的 ChIP delution buffer至 1.5ml 离心管中，然后加入充分悬浮 的 Protein A/G Dyna beads 50μl，4℃，在静音混合器上洗涤 10min，之后置于磁力架上 2min，中间轻轻颠倒磁力架，使管盖上的磁珠重悬，打开盖子直接在磁力架上弃管中液体，重复以上步骤三次。最后用 1ml ChIP delution buffer重悬。每个样品准备两管，分别标注为 Tube A‘(Antibody)和 Tube B‘(IgG or No-Antibody )。
b) 在标记为 Tube A‘的离心管中加入 5μg 抗体，在标记为 Tube B‘的离心管 中加入 IgG 或者不加抗体，将离心管置于 4℃静音混合器上，颠倒旋转孵育过夜（6~10h），让抗体和磁珠结合。
注意： a：加入抗体的多少由抗体的效价，样品的多少等诸多因素决定。一般而言， 每 25μg 的染色质 DNA 加入 5μg 的抗体。实验者亦可根据实际情况进行增减。
2. 染色质的预处理 (Tube A 和 Tube B)
a) 取 1ml 的ChIP delution buffer至 1.5ml 离心管中，然后加入充分悬浮的 Protein A/G Dyna beads 40μl，在静音混合器上洗涤 10min，4℃，之后置于磁力架上 2min，中间轻轻颠倒磁力架，使管盖上的磁珠重悬，打开盖子直接在磁力架上弃管中液体，重复以上步骤三次。最后用 1ml ChIP delution buffer重悬。每个样品准备两管，分别标注为 Tube A(Antibody)和 Tube B(IgG or No-Antibody)。
b) 取出 C）第3 步中保存在-80℃的片段化染色质溶液，4℃离心，12,000×rpm， 5min，吸取 20μl 上清作为 Input 对照。 注意： 此处可以取 10ul 上清用于后续 western 检测的。
c) 将剩余的上清小心的平均转移到 a)中的 Tube A 和 Tube B 离心管中，将 离心管置于 4℃静音混合器上，孵育 1-6 h，以消除背景。
3. 免疫沉淀
a) 将 2 步中的 Tube A， Tube B 和 3 步中的 Tube A‘， Tube B‘同时置于磁力架上， 2min，用枪小心吸掉 Tube A‘， Tube B‘的上清，然后用枪小心将Tube A，Tube B 中预处理的染色质溶液转移至对应的 Tube A‘，TubeB‘ 离心管中。
b) 将离心管置于 4℃静音混合器上，孵育12h以上。
ChIP delution buffer 10ml
1.1% Triton X-100mM EDTA 20% 0.55 ml
1.2 mM EDTA 0.5 M 0.024 ml
16.7 mM Tris-HCl (pH8.0) 1 M 0.167 ml
167 mM NaCl 5 M 0.334 ml
ddH2O 8.925 ml
E）洗脱蛋白质-DNA 复合物并释放 DNA（ 4℃）：
1. 孵育结束后，将离心管置于磁力架上，直接拿着磁力架弃管中上清，按顺序依次加入下列 wash buffer 各 1ml，颠倒离心管让磁珠完全悬浮，然后将离心管置于磁力架上，2min，直接拿着磁力架弃管中上清。
a) Low salt buffer 一次快速，一次 5min
b) High salt buffer 一次快速，一次 5min
c) LiCl wash buffer 一次快速，一次 5min
d) TE buffer 一次快速，一次 5min
Low salt buffer 100ml
150 mM NaCl 5 M 3 ml
0.1% SDS 10% 1 ml
1 % Triton X-100mM EDTA 内容过长，仅展示头部和尾部部分文字预览，全文请查看图片预览。 0μl 0.5M EDTA， 20μl 1M Tris-HCl(Ph7.0)， 2μl Proteinase K（ 10mg/ml）和 5ul RNase A(10mg/ml)，45℃水浴 1h。
2. 取出离心管，加入等体积的24:1，手摇混匀 5min， 12,000×rpm离心10min， 吸上清（ 480～500μl）至新2ml离心管中，加入 100μl 3M NaAc， 900μl 预冷的无水乙醇和 2μl 甘糖原，置于-70℃ 1h以上或-20℃过夜。
3. 4℃离心，12,000×rpm，15min，小心弃上清，加入 1ml 70%乙醇漂洗一遍，4℃离心 12,000×rpm，5min，小心弃上清，稍离心，用枪头小心吸干剩余残液，之后将离心管置于超净台上风干大约 15左右，加入 50μl TE buffer 室温溶解半小时以上。
4. 用Picogreen assay (Invitrogen Q-bit)和 Agilent BioAnalyzer DNA 1000 chip分别对 DNA 的浓度和质量进行检测，样品置于-20℃保存或进行后续illumina建库。
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