实验室抗体标志流程
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实验室抗体标志流程
1、细胞膜表面标志染色
1.1根据确定的染色抗体及实验室准备试管，并标记
1.2在每支试管中加入5*1o^5 细胞与管某某
1.3在每支试管中加入5ul(参考实际说明)不同荧光速标记的抗体，与细胞悬液充分混匀，置室温，避光15min.
1.4在每管细胞中加入1*溶血素2ml，充分混匀细胞，置室温，避光10min. 1.5离心1050rpnr5min,弃上清。
1.6加入pbs2ml后再混匀，离心1050rpnr5min，弃上清混匀细胞
1.7 加入0.5mlpbs后再混匀，上机检测
注意：如果非血液标本含有较多红细胞，也要做红细胞裂解，我室标本常规采用先做膜表面标记后溶红细胞的的方法、，如果在染色之前裂解红细胞，需要注意：a 裂解某某不会破坏细胞的抗原性.，b为了保证抗体结合的细胞动力学不受影响，需充分洗涤2次、确保完全去除细胞裂解某某。c裂解某某中不含固定剂成分，（固定剂会改变细胞活性，做表面标芯分析的时候产生可疑结果。)BD的市售红细胞解某某含固定剂
2胞膜和细胞内标志同时染色
2.1如染颗粒酶，穿孔素抗体，用BD公司的穿孔剂(perm2)，按以下步骤进行：
（1）如同时染细胞表面标志，在每支试管中加入5ul(参考试剂说明)不同散设光谱荧光素标记的抗体，与细胞血液充分混匀。置室温，避光15分钟。
（2)在每管细胞中加入1倍的溶血索2ml，充分混匀细胞，置室温，避光10分钟。
（3)离心1050rpm5分钟，弃上清，混匀细胞
（4）加入PBS2ml后再混匀，离心1050rpm5分钟，弃上清，混匀细胞。
(5)加入1*BD穿孔剂0.5ml后用力振荡，置室温，避光10分钟。
（6），加入PBS2ml离心1050rpm5分钟，弃上清，混匀细胞。
（7)加需胞内染色的抗体，置室温，避光15分钟，混匀细胞。
（8)离心1050rpm5分钟，弃上清，混匀细胞。
（9)加入PBS2ml，离心1050rpm5分钟，弃上清，混匀细胞。
（10)加入PBS2ml，离心1050rpm5分钟，弃上清，混匀细胞。
（11）加0.5mlPBS 后再混匀，上机检测
2.2 ckappak/clambda，用库尔特破膜剂，按以下步骤进行：
（1)如同时染细胞表面标志，在每支试管中加入5ul(参考试剂说明)不同散射光谱荧光素标记的抗体，与细胞混悬液充分混匀，置室温，避光15分钟。
（2)按原加入标本量的2倍体积(约100ul)加入1号试剂，置室温，避光15分钟，
（3）加PBS2ml，离心1050rpm5分钟，用吸管沿液面吸掉上清，轻混匀
(4)同量加入2号试剂（约100ul）请混匀。置室外，避光5min
（5）加入胞内染色的抗体，置室温，避光15min，混匀细胞
（6）加入PBS2ml离心1050rpm5min，弃上清，混匀细胞。
（7）加入PBS2ml再混匀、离心1050rpm5min，弃上清，混匀细胞。
(8)加入PBS0.5ml后再混匀。上机检测，
3其他胞内抗体(如MpO、Kf67、TDT、lgM.CD3、cyclinD1、bcl-2等)使用BD破膜剂
3.1取5*10^5细胞，分别加入5ull（参考剂量)包膜标记抗体，避光室温孵育15min
3.2加入100ul破膜剂A,避光室温孵育5min
3.3加入1*溶血素2ml、充分混匀细胞，置室温，避光10min。离心1050rpm5min，弃上清，
3.4加入50ul破裂剂B,加入胞浆抗体，避光室温孵育15min
3.5加入PBS2ml再混匀，离心1050rpm5min，弃上清，混匀细胞，加0.5ml 内容过长，仅展示头部和尾部部分文字预览，全文请查看图片预览。 lPBS,混匀，37度孵育5min
(2) 离心1050rpm5min，弃上清混匀细胞
(3)加入PBS2ml后再混匀，37度孵育5min
(4)离心1050qpm5min，弃上清混匀细胞
(5)按照胞膜染色步骤进行
4.4.2胞浆染色
(1) 取5*10^5细胞，加入2mlPBS,混匀，37度孵育5min
(2) 离心1050rpm5min，弃上清混匀细胞
(3)加入PBS2ml后再混匀，37度孵育5min
(4) 离心1050rpm5min，弃上清混匀细胞
(5)胞膜和胞浆免疫球蛋白、轻链按照库尔特穿孔剂胞膜+胞浆染色步骤进行CD41a、CD61染色按照BD公司胞膜+胞浆染色步骤进行。
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